Strategies to control plasmid copy number

Die Gentherapie erscheint viel versprechend, fehlerhafte Gene auf transkriptioneller oder translationeller Ebene stillzulegen oder diese durch Rekombination mit funktionellen Genen zu korrigieren. Vor nicht allzu langer Zeit revolutionierte die Gentherapie die moderne Medizin und mehr als tausend vorgeschlagene oder laufende klinische Versuche wurden weltweit genehmigt. Um das Potential der medizinischen Gentherapie und DNA-Impfung in die Praxis umzusetzen, muss die Herstellung hochreiner Plasmid-DNA (pDNA) sichergestellt werden, die frei von jedweder bakteriell chromosomaler DNA, RNA, Proteine und Endotoxine sein muss. Es ist bekannt, dass die Plasmidkopienzahl und Plasmid-Stabilität wesentliche Determinanten sind, die die Gendosis in der Wirtszelle beeinflussen. Daher ist das rationale Design eines pDNA Vektors ein großes Ziel im Rahmen der Gentherapie. Weiters ist bekannt, dass die Regulierung der PCN entscheidend ist, um eine metabolische Belastung der Wirtszelle zu verhindern, da sich eine übermäßige Plasmidreplikation wachstumshemmend auswirkt oder gar bis hin zum Zelltod führen kann. In dieser Arbeit sollte die Konzentration von Plasmiden des ColE1-Typs durch Überexpression des Gens rssB sowie tRNAAlaU in Escherichia Coli (E. coli) reguliert werden, die sich in der Literatur als erfolgreich erwiesen haben. Im ersten Ansatz wurde das für die tRNAAlaU codierende Gen, das unter die Kontrolle des T7 Promoters gebracht wurde, in das E. coli Genom inseriert. In Schüttelkolbenexperimenten wurde die Überexpression des tRNAAlaU-Gens durch Zugabe von IPTG induziert und anschließend wurde dessen Auswirkung auf drei verschiedene Plasmide des ColE1-Typs getestet. In einem zweiten Ansatz sollte die Überexpression des Gens rssB, das ebenso unter der Kontrolle des T7 Promotors stand, zu einer Erhöhung der Plasmidkonzentration nach IPTG-Zugabe führen, wobei der biologische Mechanismus bisher noch nicht vollständig geklärt ist. In Schüttelkolbenexperimenten wurde eine rssB-Überexpression durch Zugabe von IPTG induziert. Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine Überexpression von rssB und tRNAAlaU zu einer sichtbaren Erhöhung der Plasmidkonzentration des ColE1-Typs geführt hat.Gene therapy holds its promises to silence dysfunctional genes on either transcriptional or translational level or by replacement with functional genes. Not long ago it has revolutionized modern medicine and since then thousand clinical trials have been authorized worldwide. To put the medical profit of gene therapy and DNA vaccination into practice, methods to produce highly pure plasmid DNA (pDNA) free from bacterial chromosomal DNA, RNA, proteins and endotoxins have to be developed. Since it is known that plasmid copy number (PCN) and plasmid stability are affecting the success of gene therapy to a large extent, the rational design of an optimized vector is an ultimate ambition. To prevent excessive plasmid replication, posing metabolic burden resulting in growth inhibition right up to cell death to the workhorse Escherichia coli (E. coli), regulation of PCN is to be considered in the rational design of any vector as well. In this work the main goal was to elaborate a system that regulates plasmid replication of ColE1-type plasmids in Escherichia Coli (E. coli) by overexpressing tRNAAlaU and rssB encoding genes. In the first approach the wt and mutated tRNAAlaU gene, whose expression was controlled by the T7 promoter, was inserted into the E. coli chromosome. In shake flask experiments overexpression of the tRNAAlaU gene was induced by addition of IPTG and subsequently its effect on three different ColE1-type plasmids has been tested. In the second approach, overexpression of rssB, whose expression was also controlled by the T7 promoter, should result in enhanced plasmid concentration after IPTG induction whereas the biological mechanism remains unclear. In shake flask experiments, rssB overexpression was also induced by adding IPTG. All in all, the experimentally gained data have demonstrated clearly that overexpression of rssB and tRNAAlaU encoding genes resulted in enhanced plasmid concentration of ColE1-type plasmids